紫外分光光度計的性能檢驗實(shí)驗
實(shí)驗室k / 2019-08-07
一、目的
本實(shí)驗使學(xué)生初步掌握紫外分光光度計部分性能的鑒定方法及儀器的使用方法。
二、提要
分光光度計性能的好壞，直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確程度。各國藥典中所采用的分光光度法大致分兩類：一以美國藥典為代表，不給出純品的吸收系數(shù)，但需備有標(biāo)準(zhǔn)品，測定時樣品和標(biāo)準(zhǔn)品同時操作，以抵消儀器的誤差；另一以英國藥典為代表，項目中給出純品的吸放系數(shù)，定量時與已知的吸收系數(shù)相比較即可，但對儀器的性能要求甚高。我國目前采用英國藥典常用法。
三、方法
1.吸收池的配對性 石英制的吸收池對紫外線亦稍有吸收，1cm的吸收池在220~280nm的波長范圍內(nèi)，以空氣為100％，其透光率往往小于100％，且每個吸收池吸收多少也不完全相同，在每次測定前應(yīng)做吸收池的配對檢驗。
檢驗方法同比色法中比色皿的檢驗。
2.波長精度和重現(xiàn)性 用氫燈校正379～656nm一段譜帶中的幾個譜線，229～268nm一段譜線可用苯的吸收峰校正。
先以486.13nm氫燈譜線來校正儀器。將選擇開關(guān)轉(zhuǎn)至×0.1，透過率讀數(shù)放在100(或?qū)⑦x擇開關(guān)轉(zhuǎn)至×1透過率讀數(shù)放在10)，關(guān)小狹縫打開光門，緩緩轉(zhuǎn)動波長旋鈕尋找氫燈486.13nm峰出現(xiàn)的位置，然后按下列氫燈譜線測試656.28、581.21、486.13、434.05、379.79nm。
在短波段，因氫燈無分裂的譜線，可用苯的吸收峰校正波長。在25ml容量瓶內(nèi)，滴入一滴苯(A.R.)，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻后，以無水乙醇為空白，在225～270nm間用1cm石英池測定吸收度，苯在無水乙醇中的吸收峰如下：
229.2 233.9 238.9 243.3
248.5 254.5 260.6 268.4
在吸收峰附近每隔0.1nm測一讀數(shù)。
此外也可用鏷釹玻璃檢查波長精度，751型及CΦ-16型均備有鐠釹玻璃濾光片。
對波長精度和重現(xiàn)性的要求如下表(汞燈譜線)。
汞燈譜線的波長與精度及重現(xiàn)性的要求
| 波長(nm) |
精度(nm) |
重現(xiàn)性(nm) |
|
230.21
237.83
253.65
275.28
296.73
312.57
365.02
404.66
|
±3.0
±3.0
±3.0
±3.5
±3.5
±0.45
±0.60
±0.70
|
±0.15
±0.15
±0.15
±0.20
±0.20
±0.30
±0.30
±0.35
|
注：如用氫燈測定時，可參考近似的汞燈波長以確定精度與重現(xiàn)性的要求。
3.分辨率 用汞燈，狹縫寬度為0.02mm時，汞的365.02、365.48及366.33nm三條譜線應(yīng)能分清，在儀器上有明顯反應(yīng)。
4.吸收值精度和儀器線性范圍
(1)儀器和試劑：感量為0.1mg的分析天平，天平和砝碼應(yīng)經(jīng)過檢定，合乎要求。500ml容量瓶、25ml容量瓶，凡容量儀器均應(yīng)經(jīng)過校正合格。
蒸餾水應(yīng)用玻璃磨口蒸餾器重蒸，貯于帶玻璃塞的瓶中。
0.02mol/L的H2SO4(A.R)，用上述蒸餾水配制，不必標(biāo)定，但應(yīng)一次配成1500ml以上，備用。
重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)試劑備用。
(2)溶液配制方法：精密稱取在105℃干燥至恒重的重鉻酸鉀基準(zhǔn)試劑0.2g(稱準(zhǔn)至0.1mg)，置500ml容量瓶中，用0.02mol/L的H2SO4液溶解，并稀釋至500ml，搖勻。
用滴定管精密量取上述重鉻酸鉀溶液1ml、2ml、3ml、…、10ml分別置于25ml容量瓶中，均用0.02mol/L的H2SO4稀釋至刻度，搖勻。
(3)測定方法：選好配對的1cm石英比色池，以0.02mol/L的H2SO4為空白，在波長235nm處測定各試液的吸收值(當(dāng)吸收值大于1后，用×01檔)。
(4)計算方法：根據(jù)稱樣及稀釋度，計算出各個的吸收系數(shù)，在直角坐標(biāo)紙上，以各吸收值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸收系數(shù)為縱坐標(biāo)，繪出吸收系數(shù)-吸收值曲線。
一般來說，儀器測出的吸收系數(shù)，在吸收值過小時，常偏高，過大時，常偏低，其間有一段坪區(qū)，在這區(qū)間測出的吸收值計算出的吸收系數(shù)是一個常數(shù)，它與平均值的偏差不超過±0.2％的一段，為這臺儀器的線性范圍或最佳工作范圍。
波長(nm) 吸收系數(shù)(E1cm1%) 允許誤差
235 124.3 122.0~125.5
5.雜散光 用有玻璃接口的蒸餾器重蒸的蒸餾水和試劑規(guī)格的氯化鉀1.2g，配成100ml水溶液。以蒸餾水作為空白，用1cm吸收池在200nm波長測定，透過率應(yīng)小于1.0％。
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